脂質體轉染實驗中的DOTMA和DOPE有何作用？

 AVT為大家帶來幾款新型注射級陽離子脂質材料，包括DMG-PEG2000，DOTMA等，本期AVT小編給大家分享一下DOTMA和DOPE在脂質體轉染實驗中的應用，好奇的小伙伴速來圍觀！

 脂質體轉染實驗步驟

 脂質體(LR)試劑是陽離子脂質體DOTMA和DPE的混合物(1:1)。它適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中，是目前條件下最方面的轉染方法之轉染率高，優于磷酸鈣法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA轉染到各種細胞。用LR進行轉染時，首先需要優化轉染條件，應找出該批LR對轉染某一特定細胞適合的用量、作用時間等，對每批LR都要做，先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時間，DNA可從1-5ug和孵育時間6h,開始按這兩個參數繪出相應LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者佳的劑量，確定出轉染時間，因LR對細胞有一定的毒性，轉染時間以不超過24h為宜。

 細胞種類：C0-7、BHK、NIH-3T3、Hela和 Jurkat等任何一種細胞均可作為受體細胞。

 1、操作步驟(方法一)

 1）取6孔培養板，向每孔中加入2m1含(1-2)x105個細胞的培養基，37℃、18%C02培養基40%-60%匯合時。

 2)轉染液制備：在聚苯乙烯管中制備以下兩液(為轉染1個空細胞所用的A液：用不含血清培養基稀釋DNA使濃度為1-10ug,終量100u1。B液：用不含血清培養基稀釋LR,使終濃度為2-50ug,終量100u1輕輕混合A液、B液，室溫中置10-15min,稍后會岀現微濁現象，但并不妨礙轉染

 3)轉染準備：用2m1不含血清培養基漂洗2次，再加入1m1不含血清培養基

 4)轉染：把AB復合物緩緩加入培養基中，搖勻，置37℃溫箱中6-24h吸除無血清轉染液，換入正常培養基繼續培養

 5)其余處理：如觀察、篩選、檢測等與其他轉染法相同

 6)注意：轉染時切勿加血清，血清對轉染效率有很大影響。

 2、快速脂質體轉染法操作步驟(方法二)

 ●……將細胞以5x105個/孔接種于6孔板中培養24h,使其達到50%-60%板底面積。

 ●……在試管中配制DNA-脂質體復合物

a、在1m1無血清DMEM中稀釋PSV1-neo質粒DNA或供體DNAb、旋轉1s,再加入脂質體懸液，旋轉。

c、室溫下放置5-10min,使DNA結合在脂質體上。

 ●……棄去細胞中的舊液，用1m1無血清DMEM洗細胞1次后棄去，向每孔中直接加入1m1DNA-脂質體復合物，37℃培養3-5天再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM,繼續培養14-24h。吸出DEM-DNA-脂質體混合物加入新鮮含10%胎牛血清的DMEM,2m1/L,再培養24-48h。用細胞刮或消化法收集細胞，以備分析鑒定

 3、穩定的脂質體轉染法

 ●……接種細胞同前述，細胞長至50%

 ●……DNA-脂質體復合物制備轉染細胞同前。

 ●……在每孔中加入1m1含20%胎牛血清的DMEM,37℃培養48h。

 ●……吸出DEM,用G418選擇性培養基稀釋細胞，使細胞生長一定時間篩選轉染克隆，方法參照細胞克隆篩選法進行。

 細胞轉染技術總述

 一、細胞轉染途徑

 轉染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于物理介導技術；化學介導方法很多，如經典的磷酸鈣共沉淀；

 脂質體轉染方法、和多種陽離子物質介導的技術；生物介導方法，有較為原始的原生質體轉染，和現在比較多見的各種病毒介導的轉染技術

 1、物理介導

 1）電穿孔法：靠脈沖電流在細胞膜上打孔而將核酸導入細胞

 優點：轉染效率較高

 缺點：需要昂貴的儀器(電穿孔儀)；對細胞的損傷較大，每次轉染需要

 更多的細胞和DNA;每種細胞電轉的條件都需要進行多次優化

 2)顯微注射：借助顯微注射器直接把DNA注入核內，使之整合入受體細胞基因組中

 優點：轉染效率高，可用于瞬時轉染和穩定轉染

 缺點：導入DNA時需要一個細胞一個細胞注射，不適合大量轉染

 3)基因槍：依賴攜帶了核酸的高速粒子將核酸導入細胞內2、化學介導

 2、化學介導

 (1)磷酸鈣共沉淀法

 磷酸鈣有利于促進外源DNA與靶細胞表面結合，氯化鈣+DNA+磷酸緩沖液按定的比例混和，形成極小的磷酸鈣-DNA復合物沉淀黏附在細胞膜表面，借助內吞作用進入細胞質。沉淀顆粒的大小和質量對于轉染的成功至關重要。

 優點:能用于任何DNA導入哺乳類動物，瞬時轉染和穩定轉染。

 缺點:轉染效率低:進入細胞的DNA只有1 %- 5 %可以進入細胞核，其中只有不到1%的DNA可以與細胞DNA整合,在細胞中進行穩定表達。重復性不佳:pH值、鈣離子濃度、DNA濃度、沉淀反應時間、細胞孵育時間乃至各組分加入順序和混合的方式都可能對結果產生影響。

 (2)脂質體轉染法

 中性脂質體是利用脂質膜包裹DNA，借助脂質膜將DNA導入細胞膜內。帶正電的陽離子脂質體，DNA 并沒有預先包埋在脂質體中，而是帶負電的 DNA自動結合到帶正電的脂質體上，形成DNA-陽離子脂質體復合物，從而吸附到帶負電的細胞膜表面，經過內吞被導入細胞。

 優點:適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞，可用于瞬時轉染和穩定轉染;轉染效率高，比磷酸鈣法高5-100倍;能夠把DN A和R N A轉染到各種細胞，轉染的穩定性好，可重復性高，轉染時好不加血清和抗生素。

 缺點:陽離子脂質體細胞毒性相對較高，對部分細胞可能會干擾細胞的代謝。

 (3)多種陽離子物質介導

 DEAE-葡聚糖介導的轉染，其原理還不清楚，可能是通過內吞噬作用而使DNA轉導進入細胞核，此法只適合暫時轉染實驗，轉染效率與DEAE-葡 聚糖濃度以及細胞與DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時間的長短很有關系，可采用較高濃度的細胞與DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時間的長短很有關系，可采用較高濃度的DEAE-葡聚糖(1g/L)作用較短時間(30 分鐘-1.5小時),也可用較低濃度(250g/L)的DEAE-葡聚糖作用較長時間(8小時)。

 3、生物介導

 病毒介導的轉染:以病毒作為載體,通過病毒感染的方式將外源DNA導入到細胞中，其中以逆轉錄病毒及腺病毒轉染系統很是常用。

 優點:整和效率高，可使外源基因在宿主細胞中長期表達，適用于難以轉染的原代細胞。

 缺點:存在潛在的安全危險性。

 二、理想的細胞轉染方法

 理想細胞轉染方法，應該具有轉染效率高、細胞毒性小、重復性好、安全、簡單等優點。病毒介導的轉染技術，是目前轉染效率zui高的方法，同時具有細胞毒性很低的優勢。但是，病毒轉染方法的準備程序復雜，常常對細胞類型有很強的選擇性，在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學介導的轉染方法，則各有其特點。

 三、細胞轉染分類

 瞬時轉染:是指外源基因進入受體細胞后，存在于游離的載體.上，不整合到細胞的染色體上。

 穩定轉染: DNA 整合到宿主細胞的染色體中。

 四、報告基因

 是一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因，是一個其表達產物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達調節序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調控序列控制下進行表達，從而利用它的表達產物來標定目的基因的表達調控。

 常用的報告基因系統:半乳糖苷酶報告系統、素酶報告系統、蛋白報告系統(GFP)等。

 五、轉染方法

 實驗用的是Invitrogen公司的Lipofectamine2000在24孔板轉染單層貼壁細胞。

 1、轉染前1天將0.5~2X105細胞接種于24孔培養板，并加入500ul不含抗生素的*培養基，以保證轉染時細胞匯合達90~95%。

 2、準備復合物

 (1)將0.8ugDNA稀釋于50ul無血清無抗生素的培養液中輕輕渾勻。

 (2)將 2ul Lipofectamine2000稀釋于50u1無血清無抗生素的培養液中，輕輕渾勻，室溫孵育5分。注意:必須在25分內進行。

 (3) 5 分后將它們混合，并輕輕渾勻，室溫孵育20分。

 3、吸去培養板的培養基，用PBS或無血清培養基清洗細胞2次。

 4、將復合物(總體積100u1)加入培養孔，前后搖動培養板使其分布均勻。

 5、將細胞放入培養箱孵育4~6h后，可以更換含血清培養液去除復合物(也可不用)。

 6、24~ 48h后可以觀察轉入基因表達情況。

 7、穩定轉染:換含血清培養基24h后將細胞以1: 10 (或更高比例)傳代，1天后更換篩選培養基篩選。

 8、優化:要保證細胞匯合率達90~95% (比較高) ; DNA/ Lipofectamine2000比率1: 0.5~1: 5，一般細胞1: 2~3。